Оомицеты рода Phytophthora являются возбудителями фитофтороза у разных видов растений и может переходить с одного растения на другое. Среди сельхозкультур фитофтороз поражает картофель, томаты, перец, баклажаны, а также плодовые деревья (Пляхневич и др., 2006). Это заболевание наиболее вредоносно своим раннем проявлением и высокой скоростью развития в течение вегетационного сезона (Филиппов, 2012). Вредоносность фитофтороза можно уменьшить с помощью интегрированной защиты, включающей использование здорового семенного материала, устойчивых сортов, а также химических средств защиты. Несмотря на значительные успехи селекции, наиболее надежным способом защиты от фитофтороза остается химический метод (Кузнецова и др., 2015). Однако после того, как были получены первые фитофтороустойчивые сорта сельхозкультур и началось их коммерческое выращивание, вскоре накопились вирулентные расы возбудителя фитофтороза. Проблемы возникли и при использовании химических методов защиты. Повсеместное их применение быстро привело к накоплению в грибных популяциях резистентных к некоторым химическим веществам штаммов (Еланский и др., 2007).
Действия нетермальной или холодной плазмы атмосферного давления на возбудителя фитофтороза сельскохозяйственных культур не исследовано и потому является актуальной задачей. Нетермальная плазма в воздухе над поверхностью суспензий клеток или биологических тканей рассматривается как генератор активных форм кислорода и азота, ионов, сольватированных/акватированных электронов (Оловянникова и др. 2020). Особенности нетермальной плазмы с температурой видимой части факела 40–42° С в том, что ее температура близка к температуре биологических объектов, что позволяет применять данный тип плазмы к живым системам (Тихонов, Гостев, 2012).
Целью данной работы стала оценка действия нетермальной плазменной струи на Phytophthora spp.
Материалы и методы исследования
Источник нетермальной плазменной струи разработан во ВНИИРАЭ, Обнинск. Создание и поддержание микроволнового (стримерного) разряда происходит в потоке аргона при давлении близком к атмосферному. Температура газа на выходе из сопла была 25…30 0С. Исследование проводили в лабораторных условиях. Использовался изолят Phytophthora spp. с картофеля, который был выделен и предоставлен из ВНИИ картофельного хозяйства имени А. Г. Лорха.
Использовали суховоздушные образцы мицелия сроком хранения от 2 мес. до 2 лет. Изучали зависимость антифитофторозной активности нетермальной плазмы от длительности экспозиции. Из обработанных плазмой и контрольных, образцов без экспозиции плазмой, готовили смывы по общепринятой методике и высевали на картофельно-сахарозный агар.
В экспериментах на споры Phytophthora spp. готовили инокулюм – смыв с поверхности картофельно-сахарозного агара с 7-ми-суточной культурой. На чашки Петри вносили 50 мкл инокулюма и засевали сплошным газоном. Экспозицию плазмой проводили после посева смыва на поверхность плотной среды. Изучали: зависимость ингибирующего действия плазмы от периода инкубации посева зооспор перед экспозицией; зависимость ингибирующего действия плазмы от длительности экспозиции. Контролем служили посевы, без предварительной экспозиции плазмой.
Посевы на чашках Петри инкубировали 15 сут при +20…22 0С. Основным показателем действия плазмы были изменения количества КОЕ на плотной среде. Процент ингибирования роста КОЕ фитопатогена определяли по формуле: ((КОЕконтроль-КОЕопыт)/КОЕконтроль)*100 %. В таблицах количественные значения представлены в виде М±σ (среднее значение ± стандартное отклонение).
Результаты экспериментов
Было продемонстрировано значительное влияние аргоновой плазменной струи на суховоздушный мицелий Phytophthora spp. Динамика числа КОЕ возбудителя фитофтороза в зависимости от длительности экспозиции плазмой приведена в табл. 1.
Таблица 1 Количество КОЕ на чашку на 10 сутки в зависимости от длительности экспозиции на мицелий
|
Длительность экспозиции, мин |
Контроль |
5 |
10 |
15 |
|
ср. зн |
220 |
161 |
6 |
3 |
|
ст. откл |
33 |
32 |
1 |
1 |
|
Степень ингибирования роста числа КОЕ % от контроля |
- |
26,8 |
97,3 |
98,6 |
Значимый эффект от экспозиции аргоновой плазмой был продемонстрирован как на суховоздушный мицелий, хранящийся 2 г., так и 2 мес. Степень ингибирования числа КОЕ Phytophthora spp. увеличивалась с возрастанием длительности экспозиции плазмой. Степень ингибирования превышала 90 % уже после 10 мин экспозиции. После 5 мин экспозиции значимого эффекта на мицелий, хранящийся 2 месяца, не наблюдалось (табл. 2).
Таблица 2 Воздействие нетермальной плазмы на суховоздушный мицелий
|
Длительность хранения мицелия |
2 месяца |
2 года |
||
|
Длительность экспозиции |
20 мин |
Контроль |
15 мин |
Контроль |
|
ср. зн |
6,50 |
151,00 |
3,00 |
219,67 |
|
ст. откл |
0,71 |
26,87 |
1,00 |
32,65 |
|
Степень ингибирования числа КОЕ, % от контроля |
95,70 |
- |
98,63 |
- |
Дальнейшие эксперимента показали высокую чувствительность зооспор возбудителя фитофтороза к воздействию нетермальной аргоновой плазмы непосредственно после посева (табл. 3). Значимой корреляции снижения количества жизнеспособных зооспор фитопатогена от увеличения времени экспозиции плазмой не зафиксировали. Уже после 1 мин экспозиции количество колоний Phytophthora spp. снижалось на 87 %. После 5 и 10 мин экспозиции происходило полное ингибирование.
Таблица 3 Количество КОЕ на 10 сутки инкубации после экспозиции зооспор плазмой сразу после посева
|
Длительность экспозиции, мин |
Контроль |
1 |
5 |
10 |
|
ср. зн |
94 |
12 |
1 |
0 |
|
ст. откл |
9 |
4,8 |
0 |
0 |
|
Степень ингибирования роста числа КОЕ % от контроля |
- |
|
100 |
100 |
В следующем варианте эксперимента экспозицию плазмой на зооспоры проводили через 1 ч и через 10 ч после посева на плотную питательную среду. Результаты также показали высокую чувствительность зооспор Phytophthora spp. к аргоновой плазме (табл. 4).
Таблица 4 Действие нетермальной плазмы на возбудитель фитофтороза в различные сроки после посева зооспор на чашки Петри
|
В различные сроки после посева до экспозиции плазмой |
Контроль |
2 ч |
10 ч |
||
|
Длительность экспозиции, мин |
- |
1 |
10 |
1 |
10 |
|
ср. зн |
199 |
10,00 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
|
ст. откл |
2,52 |
17,32 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
|
Степень ингибирования роста числа КОЕ % от контроля |
- |
94,98 |
100 |
100 |
100 |
Действие аргоновой плазмы на возбудитель фитофтороза наблюдали как через 2 ч после посева зооспор на плотную питательную среду, так и через 10 ч после посева. Степень ингибирования роста КОЕ превышала 90 % даже после кратковременной экспозиции плазмой в течение 1 мин.
Обсуждение
По результатам проведенного исследования можно сделать вывод об антифитофторозной активности нетермальной плазменной струи.
Как показали результаты исследований, нетермальная аргоновая плазма способна подавить рост зооспор возбудителя фитофтороза спустя 10 ч после попадания зооспор на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри. Эти результаты демонстрируют защитную активность плазмы, потому что в литературе указано, что прорастание зооспорангиев в зооспоры, происходящее на молодом мицелии в течение 1,5…2 ч, обеспечивает самое быстрое нарастание инфекции в поле, так как для прямого прорастания их в ростовые трубки требуется 5…8 ч (Ильяшенко Д. А. и соавт., 2010).
Таким образом, для выраженного антифитофторозного действия необходимо воздействие на споры патогена до момента заражения. На практике это актуально после уборки сельхозпродукции. Кроме того, целесообразно дальнейшее исследование эффективности нетермальной плазменной струи с целью борьбы с остатками суховоздушным мицелия на поверхности сельхозпродуктов. Этот суховоздушный мицелий в процессе хранения может дать начало развитию болезни.
Заключение
В данном эксперименте была показана эффективность нетермальной аргоновой плазмы против сухого мицелия фитопатогена. Наблюдали подавление роста КОЕ после воздействия на мицелий, хранящийся от 2 месяцев и с 2 лет. Выраженность антифунгального эффекта зависела от времени экспозиции плазмы на объект. Степень ингибирования превышала 90 % после 10 мин экспозиции.
Также в данном исследовании показано, что споры возбудителя фитофтороза гибнут перед заражением на чашках Петри. Поэтому, экспозиция плазмой должна быть проведена до прорастания спор. Наблюдали как через 2 ч после посева, так и через 10 ч после посева. Степень ингибирования превышала 90 % даже после кратковременного воздействия в течение 1 мин.
