УДК 619: 616: 981. 42
Новицкий Алексей Алексеевич
Доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней ФГБОУ ВО Омский ГАУ, г. Омск
Красиков Александр Пантелеевич
Доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней ФГБОУ ВО Омский ГАУ, г. Омск
Заболотных Михаил Васильевич
Доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животноводства и гигиены сельскохозяйственных животных ФГБОУ ВО Омский ГАУ, г. Омск

Анализ проводимых противоэпизоотических мероприятий в одном из хозяйств Северного Казахстана в соответствии с договором показал, что без средств специфической профилактики бруцеллеза одними методами диагностики предотвратить распространение данной болезни практически невозможно. В связи с этим проведено  испытание разработанной методики иммунизации против бруцеллеза  крупного рогатого скота с использованием специфического бруцеллезного иммуномодулятора (БИМ) в сочетании с вакциной из штамма  B. аbortus 82. Установлено, что применение иммуномодулятора позволяет не только провоцировать  скрытые (латентные) формы  инфекции, но и сдерживать ее распространение. Более того, за счет создания иммунного фона после применения БИМ снимаются абортогенные свойства вакцины из штамма  82, что делает безопасным ее применение на стельных животных.

Summary: Analysis conducted countermeasures in one of the farms of Northern Kazakhstan according to the agreement shows that without the means of specific prophylaxis of brucellosis among diagnostic methods to prevent the spread of the disease is almost impossible. In this connection, techniques developed test conducted immunization against bovine brucellosis using Brucella specific immunomodulator (BIM), in combination with the vaccine strain of B. abortus 82. It is found that the use of an immunomodulator to provoke not only the hidden (latent) forms of the infection, but and contain its spread. Moreover, by creating an immune background after applying BIM removed abortogennye vaccine properties of strain 82, which makes it safe to use pregnant animals.

Ключевые слова:  иммуноферментный  анализ (ИФА),  реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК), роз бенгал проба (РБП), реакция иммунодиффузии (РИД) с О-ПС-антигеном.

Keywords: enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), agglutination (PA), complement fixation (RSK), rose bengal test (BPO), the reaction of immunodiffusion (RID) with O-PS antigen.

Введение

Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу крупного рогатого скота в ТОО «Тайынша Астык» Северо- Казахстанской области, с которым университетом заключен договор, показал, что практикуемые  в хозяйстве противобруцеллезные мероприятия, ориентированные только на диагностические исследования с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) без создания иммунного фона в условиях высокого риска заражения ставят под угрозу обеспечение благополучия животных по бруцеллезу, в том числе завозимого импортного мясного скота. В имеющейся литературе имеется достаточно сведений о невозможности достичь оздоровления хозяйств без средств специфической профилактики [1,2] В связи с этим на основании последних достижений науки и практики в области специфической профилактики и поствакцинальной дифференциальной диагностики бруцеллеза университетом предложены новые подходы в системе мер по обеспечению благополучия по бруцеллезу в мясном скотоводстве.

Объекты и методы

Научно-исследовательскую работу проводили согласно договору между ТОО «Тайынша Астык» Северо-Казахстанской области и ФГБОУ ВО Омский ГАУ по оказанию научно-методической и практической помощи в разработке и реализации специальных научно-обоснованных мероприятий по профилактике бруцеллеза крупного рогатого скота. В качестве специфического средства для провокации латентных форм бруцеллеза и создания иммунитета был применен на коровах экологически безопасный специфический бруцеллезный иммуномодулятор (БИМ), разработанный во ВНИИБТЖ, представляющий нерастворимый антигенный комплекс бруцелл [3]. О провокации латентных форм бруцеллеза с помощью противобруцеллезной вакцины с описанием методики сообщается в книге академика Иванова Н.П. «Бруцеллез  животных, методы и средства борьбы с ним» [4]. Серологические исследования проводили на базе БУ «Омская областная ветеринарная лаборатория».  Бруцеллезный иммуномодулятор применяли на всем  поголовье, включая телок, нетелей, коров и быков производителей. Исследование сыворотки крови после иммунной стимуляции  проводили  через 21 сут., 2, 3, 5 месяцев.   Сыворотку крови исследовали в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), роз бенгал пробе (РБП), реакции иммунодиффузии (РИД) с О-ПС-антигеном согласно наставлению по диагностики бруцеллеза [5].

Результаты исследований

Согласно официальным данным ТОО «Тайынша Астык» числилось благополучным по бруцеллезу крупного рогатого  скота. Последняя специфическая профилактика коров вакциной из шт. 82 была проведена более 3 лет назад.  Реагирующих на бруцеллез перед прививкой не было. Однако после очередного исследования сыворотки крови в поствакцинальный период в районной ветеринарной лаборатории с использованием высокочувствительного метода ИФА было выделено 30 реагирующих на бруцеллез коров в с. Ясная Поляна. Для уточнения эпизоотического статуса по бруцеллезу было дополнительно проведено серологическое исследование на бруцеллез всего поголовья с использованием  РА, РБП, РИД с О-ПС-антигеном. Одновременно в целях выявления  скрытого течения бруцеллеза была проведена иммуностимуляция коров и телят (1-6 мес возраста) с использованием специфического бруцеллезного иммуномодулятора. Результаты исследований до и после применения БИМ представлены в таблице 1.

Таблица 1

Выявление латентного течения бруцеллеза после введения БИМ

группа	Коли-чество	Срок иссле-дования	Результаты серологических реакций
			РИД	РА МЕ			РСК титры
				50	100	200	5	10
До введения БИМ
коровы	31		—	—	—	—	—	—
телята	50		—	—	—	—	—	—
После введение препарата БИМ
коровы	31	21 сут	—	10	2	—	15	—
телята	53	21 сут	—	5	1	—	17	—
коровы	31	2 мес.	—	—	—	—	—	—
телята	58	2 мес.		—	—	—	—	—

Для сравнительного анализа были взяты две группы: коровы и телята. Из таблицы видно, что в результате исследования сыворотки крови перед введением БИМ не зарегистрировано реагирующих ни в одной из применяемых серологических реакций, несмотря на то, что предварительно в стаде регистрировали  реагирующих в ИФА. Полученные данные указывают, что использование высокочувствительного метода ИФА для исследования на животных даже в отдаленные сроки после иммунизации вакциной из штамма 82 неприемлемо, поскольку выявляются особи носители поствакцинальных антител. После применения  иммуномодулятора поствакцинальные антитела выявлены в низких титрах у отдельных животных только в короткий срок после его применения (21 сут.) — РА 50,100 МЕ и РСК только 1:5, которые полностью угасли  к 2-м месяцам. Дифференциальным тестом в данном случае являлась РИД с О-ПС-антигеном, которая показала отрицательный результат, что свидетельствовало о благополучии фермы (с. Ясная Поляна) по  бруцеллезу.

Несколько иная картина установлена в селе  Зеленый Гай (гурты Кумысное, Черный Стан)  на импортном крупном рогатом скоте мясного направления, где также ранее были установлены животные, реагирующие положительно в ИФА. Так, в гурте  №1  (Кумысное) при исследования сыворотки среди крупного рогатого скота были выявлены положительно  реагирующие животные с высокими титрами РА, РСК и положительной РИД, После удаления реагирующих животных был применен иммуномодулятор. Результаты исследования до и после иммуностимуляции приведены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты серологического исследования сыворотки крови на бруцеллез до и после введения иммуномодулятора ( РИД, РА, РСК)

Коли-чество	Срок иссле-дования		Результаты серологических реакций
			РИД	РА МЕ			РСК титры
				50	100	200	5	10	20
206	Не вакц.		6	18	4	4	12	6	5
Первое введение препарата
195	21 сут.		—	27	79	10	21	29	32
174	2 мес.		1	24	18	3	27	16	1
168	3 мес.		0	5	2	0	0	0	0
Второе введение препарата через 3 месяца
154	21 сутки		4	31	28	3	23	19	7
158	2 мес.		0	10	8	2	5	2	0

Из данных приведенных в таблице наглядно прослеживается  провоцирующее свойство иммуномодулятора, характеризующееся резким увеличением количества положительно реагирующих на бруцеллез животных на 21 сутки после его применения. Последующие  исследования сыворотки крови крови животных через 2 и 3 месяца свидетельствуют о заметном  снижении эпизоотической напряженности.  Через три месяца уже не регистрировали животных с противобруцеллезными антителами, после чего бруцеллезный иммуномодулятор был введен повторно.

Повторное введение вновь спровоцировало всплеск реакций у бруцеллоносителей, на 21 сутки было выделено четыре головы с положительной РИД, четыре с высокими титрами в РА  и девять в РСК в высоком разведении. Эти животные были удалены из стада.

Гурт № 2 (Черный Стан). Коровы этого стада четыре года назад  были иммунизированы вакциной из шт. 82. При поствакцинальном исследовании в настоящее время  в стаде также были зарегистрированы животные, реагирующие в ИФА. На таком иммунологическом и эпизоотологическом фоне на коровах и телятах был применен бруцеллезный иммуномодулятор. Результаты исследования до и после введения иммуномодулятора показаны в таблице 3.

Таблица 3

Результаты серологического исследования сыворотки крови животных  гурта № 2 до и после введения иммуномодулятора

Коли-чество	Срок иссле-дования	Результаты серологических реакций
		РИД	РА МЕ			РСК титры
			50	100	200	5	10	20
204	8 мес	14	34	5	7	16	10	6
Первичное введение БИМ
185	21 д.	14	14	49	39	5	41	39
169	2 мес.	4	22	12	5/4	38	21	6
155	3 мес.	0	29	4	0	8	2	0
Повторное введение химической вакцины
154 к+т	21 д.	2	34	17	3	23	18	13
152 к+т	2 мес	0	10	8	0	5	2	0

Из приведенных таблиц видно, что основным дифференцирующим тестом, позволяющим отличать истинно больных животных от вакцинированных является РИД с О-ПС-антигеном. Об этом же свидетельствуют сообщения ряда исследователей [6, 7,] Так результаты исследований животных  гурта Черный Стан практически повторяют результаты исследований гурта Кумысное.  В таблице 3 отмечено наибольшее количество скрыто больных животных, которых можно выявить лишь после провокации бруцеллезным иммуномодулятором. В данном случае уже через три месяца после провокации удалось резко снизить количество реагирующих на бруцеллез животных, и добиться отрицательных показателей РИД с О-ПС антигеном. После удаления реагирующих животных и для окончательного оздоровления — выявления скрытых бруцеллоносителей было проведено повторное введение иммуномодулятора, которое позволило через 21 сутки еще выявить более 30 животных, явно больных бруцеллезом. При очередном исследовании через два месяца регистрировали лишь животных с поствакцинальными реакциями.

Анализ результатов исследований коров  села Зеленый Гай  показал, что при проведении ранней диагностики в период с 14 суток до 1,5 мес. после введения иммуномодулятора также выявляются животные  c латентной формой инфекции, что подтверждается РИД с О-ПС антигеном.  При последующих исследованиях и удаления больных из стада наблюдается угасание реакций, улавливаемых РА и РСК (таблица 4)

Таблица 4

Результаты исследования коров ф.Зеленый Гай после провокации бруцеллезным иммуномодулятором

группа	Коли-чество	Срок иссле-дования	Результаты серологических реакций
			РИД	РА МЕ			РСК титры
				50	100	200	5	10	20 и выше
Коровы	291	7 мес.	3	24	14	2	10	2	1
БИМ
Коровы	86	7 сут	0	7	5	1	15	3	—
Коровы	267	14 сут.	12	58	103	46/3	67	32	23
Коровы	332	21 сут.	9	81	74	94/7/1	49	23	12
К+телки	499	1,5-2 м	4	87	49	0	29	9	3
коровы	344	4-5 мес	2	63	24	6	50	14	5

Провоцирующие свойства химической вакцины были отмечены и в более отдаленные сроки  при исследовании телок перед случкой (таблица 5)

Таблица 5

Результаты исследования нетелей и телок случного  возраста ф.Зеленый Гай после провокации БИМ

группа	Количество	Срок иссле-дования	Результаты серологических реакций
			РИД	РА МЕ			РСК титры
				50	100	200	5	10	20
нетели	83	8 мес.	1	—	—	—	1	—	—
Тел п / сл.	125	8 мес.	2	3	1	0	3	2	—
Иммуностимуляция БИМ
Тел п / сл.	105	3 мес.	12	13	12	5	4	7	6/3/1
Тел п / сл..	100	4 мес.	2	15	1	2/1	15	4	2/1

Примечание: п/сл. — телки перед случкой

Из данных таблицы 5 видно, что  из 218 гол., исследованных в РИД, было выявлено всего три головы (2,8%), а через три месяца после провокации БИМ было зарегистрировано 12 (11,4%) больных  бруцеллезом животных.

После достижения показателей, характеризующих отсутствие бруцеллезной инфекции (отрицательная РИД с О-ПС антигеном, низкие титры РА, РСК), все поголовье коров  хозяйства без учета периода стельности было иммунизировано противобруцеллезной вакциной из штамма  B. аbortus 82.  В период наблюдения за привитыми животными в поствакцинальный период случаев абортов не зарегистрировано.

Заключение

Результаты проведенных исследований  наглядно свидетельствуют о необходимости использования феномена провокации с помощью специфического бруцеллезного иммуномодулятора  для выявления латентно больных бруцеллезом животных, что позволяет сократить сроки оздоровления стад крупного рогатого скота от данной инфекционной болезни.

Отказ от иммунизации крупного рогатого скота против бруцеллеза вакциной из штамма  B. аbortus 82 или снижение регламента вакцинации в зонах повышенного риска заражения создает угрозу распространения инфекции.

Использование в качестве диагностического теста высокочувствительного метода ИФА на фоне проведения  специфической профилактики бруцеллеза неприемлемо из-за выявления животных носителей поствакцинальных антител.

Применение специфического бруцеллезного иммуномодулятора позволяет создать иммунологическую защиту животных, нейтрализующую абортогенные свойства вакцины из штамма  B. аbortus 82.

ЛИТЕРАТУРА

1. Косилов И.А., Аракелян П.К., Димов С.К., Хлыстунов А.Г. Бруцеллез сельскохозяйственных животных/ Под ред. И.А. Косилова.- Новосибирск, 1999. -344 с.

2. Концепция контроля рисков возникновения и распространения эпизоотичяеских очагов зооантропонозов: Метод. положения/ СО Россельхозакадемии.- Новосибирск, 2011.-21 с

3. Бронников В.С., Попова Т.Г., Новицкий А.А  Способ получения протективного антигенного комплекса бруцелл /патент №2398597 -2010

4. Иванов Н.П. Бруцеллез животных; методы и средства борьбы с ним / Алматы, 2006. — 506 с.

5.  Наставление по диагностике бруцеллеза животных.- М, 2004. – 62 с.

6. Чекишев В.М Дифференциация вакцинированных и больных бруцеллезом животных / Чекишев В.М, Файзрахманов Ш.Р., Киселев Б.А., Филлипенко М.Л., Колганова О.А., Хлыстунов А.Г., Димов С.К.,  Якомов В.В.,  Новицкий А.А., Попова Т.Г., Циммерман В.А. // Ветеринария. — 1993. — №  8. — С.25-32.

7. Попова Т.Г. Оценка эпизоотической ситуации в стадах с помощью О-ПС антигена в радиальной иммунодиффузии (РИД) /  Попова Т.Г.,  Новицкий А.А., Бронников В.С., Савицкий С.В. // Актуальные проблемы инфекционных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними: Матер. юбил. научн.-произв. конф. сотрудников и аспирантов / ОмГАУ. -Омск, 1998. — С. 268-272.